Cromatografía en Columna.
Separación de pigmentos vegetales

1. Objetivos

Manejo de técnicas de separación. Introducción a las sofisticadas técnicas de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y cromatografía de gases (GC).
Objetivo operativo: Separación de los componentes colorantes de los vegetales...

2. Fundamento teórico

La cromatografía en columna es la técnica de separación e identificación de sustancias químicas, por la diferente retención que experimentan los componentes de una mezcla, al ser más o menos adsorbidos por los componentes de una fase fija situada en una columna, cuando son arrastrados por un fluido (fase móvil). Si la fase móvil es líquida hablamos de cromatografía líquida y si es gas será cromatografía de gases. El adsorbente, suele ser gel de sílice o alúmina, pero pueden ser otros.

Intervienen los fenómenos de adsorción y disolución, por consiguiente es fundamental tener en cuenta la polaridad, tanto de las sustancias a arrastrar como del disolvente, si queremos tener una buena separación.

El disolvente al descender arrastra las sustancias a distinta velocidad según la mayor o menor retención que experimenten, y salen de la columna a distinto tiempo.
La técnica, en forma generalizada, comprende:

* Preparación del disolvente
* Preparación de la columna
* Desarrollo del cromatograma
* Estudio del tiempo de retención
* Revelado de las sustancias separadas, si no son visibles

El tiempo de retención es un parámetro útil porque es constante cuando se reproduce el experimento en todas las condiciones, se pone en tablas y sirve para identificar compuestos; es fundamental en Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) y en Cromatografía de Gases.

3. Material y reactivos

- Bureta como columna
- Embudo
- Erlenmeyer (3)
- Soporte y pinzas
- Gel de Sílice 60, 63-200 micras RE cód. 174275
- Etanol absoluto DIDACTIC cód. 231086
- Éter de Petróleo 40-60ºC DIDACTIC cód. 231315
- Calcio Carbonato precipitado DIDACTIC cód. 231212
- Hojas, flores amarillas, rojas,... de vegetales.

4. Procedimiento experimental

Preparación de la columna
Se toma una bureta o una pipeta como columna, se sujeta en el soporte con las pinzas.
Se engrasa la llave y se mantiene en posición de cerrado. Se introduce hasta el fondo un pequeño trozo de algodón ayudándose con la varilla de vidrio, se agregan 3 ml de Etanol absoluto DIDACTIC y se presiona suavemente el algodón para que quede bien colocado y sin burbujas, se prepara una suspensión de 15 g de Gel de Sílice 60, 63-200 micras RE en 50 ó 60 ml de Etanol absoluto DIDACTIC y se agita durante 5 minutos para eliminar las burbujas.
A través del embudo se vierte la suspensión en la columna golpeando ligeramente con los dedos para que el empacado sea uniforme.
Se abre la llave para eliminar el exceso de disolvente teniendo cuidado de no dejar secar la Gel de Sílice.
Se podría haber empaquetado en seco, pero teniendo cuidado de que no nos queden espacios vacíos, y luego pasarle disolvente, por ej. Etanol.

Preparación de la mezcla a separar
Se recogen hojas y flores verdes, amarillas, rojas,...., se ponen en un mortero, junto con alcohol y una pequeña cantidad de Calcio Carbonato precipitado DIDACTIC (que evita la degradación de los pigmentos fotosintéticos).
Se tritura la mezcla hasta que las hojas se decoloran y el disolvente adquiere un color verde intenso, se decanta y se realiza la práctica con el líquido como extracto de vegetales.

Desarrollo o elución
Cuando el eluyente haya descendido 0,5 cm de la parte superior del relleno, se añaden dos gotas del extracto. Se pone una pequeña bolita de algodón en la parte superior de la columna y a continuación se añade eluyente (Éter de Petróleo 40-60ºC DIDACTIC), manteniendo el nivel varios cm por encima del relleno. Al desarrollarse la cromatografía, se separan las fracciones, que se recogen en distintos matraces, contando el tiempo que tarda cada componente en salir (tiempo de retención).

Hacer dibujos donde figuren claramente coloreadas las separaciones de colorantes, con esquemas de las distancias recorridas cada intervalo de tiempo (20-25 minutos) y los tiempos de retención para una cierta longitud de columna (10 cm).

5. Cuestiones

a) La cromatografía en columna, sus características y aplicaciones. Cromatografia de adsorción. Cromatografía de partición.
b) Eluyentes y soportes para cromatografía en columna.
c) Factores que influyen en una separación por cromatografía en columna.

 

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